生殖细胞介导不良环境影响的跨代遗传及其表观遗传机制
张金智 袁超 曹建刚 汪晖
作者单位：武汉大学基础医学院药理学系（张金智、汪晖），发育源性疾病湖北省重点实验室（袁超、曹建刚）
通信作者：汪晖，Email：wanghui19
whu.edu.cn20世纪80年代以来，大量流行病学调查研究显示，低出生体重儿成年后代谢性疾病的发病率升高。Barker[1]在这些研究的基础上进一步提出“成年疾病的胎儿起源”假说。他认为，孕期不良环境可引起子代宫内编程（intrauterineprogramming）改变，从而导致成年后代谢性疾病的易感性增加[2]。随着该假说的发展，新的观点认为，人类在整个发育过程中的不良环境都可能对其后各生命阶段的疾病发生和发展产生影响，而不仅限于胎儿时期，因而进一步发展出“成年疾病的发育起源（developmentoriginofadultdisease）”这一概念。关于成年疾病，可能的机制假说主要包括节俭表型、发育可塑性和预知适应性反应等[3-4]。现就近年来国际上关于发育源性成年疾病的宫内起源、生殖系介导的跨代遗传现象及其表观遗传机制进行综述。
一、孕期不良环境所致子代宫内编程改变及成年多种疾病易感的跨代遗传效应
宫内不良环境所致的不良妊娠结局主要包括流产、早产、死胎、胎儿畸形和胎儿生长受限（fetalgrowthrestriction，FGR）等[5-6]。FGR是指胎儿在宫内受到不利因素的影响，出生体重或体长低于同孕龄正常胎儿的10%，其诱因包括环境因素[7]。流行病学调查显示，FGR不仅可造成胎儿窘迫、窒息和死亡等，其危害还可延续至生后，引发成年子代的疾病易感，如代谢综合征和神经精神性疾病等[8-10]。在FGR个体成年疾病易感的机制假说中，目前得到较多认可的是下丘脑-垂体-肾上腺（hypothalamus-pituitary-adrenal，HPA）轴介导的“宫内神经内分泌发育编程改变”[11-12]。该机制不仅可以通过表观遗传修饰改变延续至生后，甚至可以遗传至下一代[13]。
1.孕期不良环境导致子代成年后多种疾病易感及其跨代遗传效应：胚胎或胎儿在早期发育的关键时期，对内分泌干扰物十分敏感。“发育可塑性”学说认为，生物体能够对具体的环境做出特定的适应性反应。这种反应不仅表现为即刻的、短时间的生理和行为的变化，也可长期影响子代健康[4]。因此，宫内不良环境引起的基因与环境间的相互作用可增加子代成年后对某些疾病的易感性。研究表明，低出生体重是导致成年期心血管疾病的独立危险因素[14]。母亲孕期不良环境（如感染、压力、营养不良、酒精暴露及内分泌紊乱等）暴露可干扰子代的神经系统发育、行为和认知功能等[15-17]，并且会永久地改变胎儿的内分泌代谢状态，导致胰岛素敏感性改变，以适应生存，但这些改变可能引发子代成年后腹部脂肪堆积和2型糖尿病发生[18]。同时有证据显示，亲本不良习惯造成的负面影响能遗传多代。来自欧洲和美国的研究团队利用小鼠模型模拟了妊娠期营养不良对子代的影响，发现模型组的子代（F1代）体重较轻且更易患糖尿病。这些F1代小鼠即使生后未加以饮食限制，其子代（F2代）也可出现相似症状[19]。另有报道表明，孕期创伤也可导致后代小鼠持续3代的抑郁倾向和代谢水平改变[20]。总之，上述一系列证据提示，生物体生命早期遭受的应激刺激或非常规经历，对其后期的生命活动产生了显著影响，并且存在跨代遗传效应。
2.母源性糖皮质激素过度暴露致后代宫内编程改变：“宫内编程改变”是指胎儿暴露于不良宫内环境，其信息调控系统的构建出现了异常，重要器官或系统受到损伤，进而造成组织形态和功能的永久性改变。本实验室前期的研究提示，“母源性糖皮质激素过度暴露”可能是胎儿宫内编程改变的主要始动因素[12]。生理状况下，糖皮质激素由1型11β-羟类固醇脱氢酶（11β-hydroxysteroiddehydrogenasetype1，11β-HSD1）还原活化，而经2型11β-羟类固醇脱氢酶（11β-hydroxysteroiddehydrogenasetype2，11β-HSD2）氧化灭活[21]。孕期不良环境可通过抑制胎盘11β-HSD2表达，使胎儿过度暴露于母源性高糖皮质激素，从而导致胎儿低出生体重和多脏器发育不良[22]。
HPA轴的应激敏感性改变被认为与孕期不良环境有关。如出生前合成类糖皮质激素暴露可导致子代出生后持续性的HPA轴应激反应异常[23]。HPA轴的高位调节中枢—海马在宫内可受到环境因子的影响，而造成胎儿HPA轴发育编程改变，表现为生后HPA轴低基础活性和高应激敏感性[24]，且高脂饮食或慢性刺激会加重HPA轴的高应激敏感性[25-26]。由于咖啡因摄入所导致的高水平糖皮质激素会下调胎儿海马11β-HSD2表达，并促进11β-HSD1、糖皮质激素受体表达[27]，提示产前咖啡因暴露所致胎儿HPA轴异常相关的神经内分泌代谢编程可能起始于海马中的糖皮质激素激活。同时，糖皮质激素受体与盐皮质激素受体的平衡对于维持HPA轴的稳态和功能具有重要意义，孕期外源物暴露可打破海马中糖皮质与盐皮质激素受体的平衡，最终引起HPA轴功能紊乱，并造成疾病易感[28]。
研究发现，糖皮质激素可抑制胰岛素样生长因子1（insulin-likegrowthfactors1，IGF1）的表达[29]。孕期不良环境所致母源性糖皮质激素过暴露可抑制子代多种器官IGF1信号通路及功能发育，最终引起FGR发生、多脏器发育改变及成年后多种疾病易感。本实验室发现，子代血清糖皮质激素与肝脏、肾上腺等脏器IGF1水平变化呈现明显负相关，IGF1信号通路受高糖皮质激素抑制且常伴有糖脂代谢改变和肾上腺功能异常。这些变化可延续到生后，表现为宫内高血清糖皮质激素水平下，脏器IGF1信号通路表达降低；而出生后低血清糖皮质激素水平下，各脏器IGF1信号通路表达升高[30-32]。基于此推测，“宫内糖皮质激素-IGF1轴”编程可能是FGR子代出生后追赶生长和成年慢性疾病易感的核心机制。
3.子代宫内编程改变中的表观遗传机制：宫内编程的过程中伴随着一系列基因表观遗传修饰的改变。作为宫内编程的诱因，孕期不良环境能够改变某些基因的表观遗传修饰状态，从而诱导这些基因的表达变化。例如，孕期大鼠受到约束应激，胎盘和子代海马的11β-HSD2基因启动子区出现特定位点高甲基化，并伴随DNA甲基转移酶3A（DNAmethyltransferase3A，DNMT3A）水平的显著升高[24]。母子分离模型中，下丘脑室旁核神经元精氨酸加压素基因下游的增强子甲基化水平降低是导致HPA轴应激敏感性升高的重要原因[33]。
母源性高糖皮质激素在编程胎儿肾上腺早期发育的过程中，存在一系列的组蛋白去乙酰化修饰[34-35]。此外，母体摄入高水平外源性糖皮质激素，也会引起胎儿海马中多个基因启动子的H3K9乙酰化水平降低。这些组蛋白修饰改变可延续至出生后并持续存在，最终造成胎儿HPA轴功能紊乱，以及出生后神经行为异常[36]。本实验室研究证实，孕期咖啡因暴露会导致肝脏IGF1组蛋白甲基化异常，从而引起其下游信号通路抑制[37]。同时，胚胎期铁缺乏可引起大鼠成年后脑源性神经营养因子位点的染色质重塑改变，从而导致脑源性神经营养因子表达下调[38]。胚胎期宫内应激引起胎儿出生后长期情感与认知障碍的研究也证实了微小RNA等非编码RNA介导了环境对胎儿的编程效应[39]。在上述一系列可影响后代各器官结构与功能发育的编程过程中，表观遗传修饰扮演着重要角色，甚至可能作为不良环境影响跨代遗传的重要媒介。
二、生殖细胞介导表观遗传信息的跨代遗传
跨代遗传一方面是指单代暴露于环境因子、生殖系细胞表观遗传组发生改变并进行多代传递，另一方面是指环境因子分别作用于每一代而引起的跨代遗传表型。内源性和外源性跨代遗传表型概念的提出，进一步明确了二者的区别。“内源性跨代遗传”界定的关键在于，代间生殖系的表观遗传改变是否源于直接的环境因子暴露[40]。例如，孕期不良环境暴露时，环境因子暴露于F0代孕期母亲、F1代胚胎及其生殖细胞（F2代），因此F1、F2代并不属于跨代遗传现象。而F3代没有遭受环境因子直接影响，因而属于内源性跨代。“外源性跨代遗传”则需要对每一代都进行环境因子刺激，以强化体细胞的表观遗传修饰，一般不涉及生殖系[41]。许多跨代表型中都存在不同的传递方式，包括内源性和外源性跨代，及其共同作用。
1.生殖细胞介导跨代遗传效应：在过去几年中，支持生殖细胞介导环境诱导型性状跨代遗传的证据越来越多。亲代配子的表观遗传因子会导致后代表型改变，其中涉及基因表达和表观遗传调控的复杂过程被认为具有跨代影响。例如，在胚胎发育的性腺分化时期，孕鼠烯菌酮暴露会损害精子发生过程并引发雄性不育，该影响可持续到F4代[42]。另外，孕鼠暴露于双酚A会影响子代精巢类固醇激素受体及其共调节因子的表达，从而导致可延续至F3代的精子数量减少及其活性降低[43]。在一项小鼠孕期和哺乳期高脂饮食的研究中，某些表型的出现可能只传递到F1代（如体型肥胖），也可以跳过F1代而出现在F2代（如胰岛素敏感性降低），有的还会出现跨代传递的性别差异（如F3代的胰岛素敏感性改变只体现在雄性）[44]。由于父系只通过精子参与遗传过程，因此通过父系传到F3代的表型表明精子具备稳定传递表观遗传修饰的潜力。另一项研究中，小鼠孕期尼古丁暴露可导致F1至F3代均出现注意力缺陷和多动障碍，且该表型跨代遗传的出现可能是生殖细胞基因组表观遗传修饰改变的结果[45]。而孕期营养缺乏诱导的FGR胎儿生后具有持续2代的印记基因甲基化修饰和表达改变[46]，提示诸如H19/IGF2基因的印记状态可能是解释表型跨代传递和存在性别差异的依据。
虽然基于遗传基因组的研究已经证实机体内的确存在能导致个体间疾病易感性不同的基因，但由于基因组具有冗余性和稳定性，且存在DNA修复等基因组保护机制，大多数环境因素并不能导致可遗传的DNA序列改变，所以在生殖细胞介导的跨代遗传效应中，其跨代机制更有可能与基因组的表观遗传修饰关系密切。
2.跨代遗传中的表观遗传重编程：表观遗传标记的生成和消除在发育过程中时有发生。在发育过程中，会出现2次大规模的表观遗传标记消除，包括DNA甲基化和组蛋白修饰等[47]。以DNA甲基化为例。第一次去甲基化发生在胚胎期形成原始生殖细胞的过程中，这些细胞中源自亲本的DNA甲基化特征被消除，并在生殖细胞的成熟过程中重新建立；第二次广泛的去甲基化过程发生在受精过程中，即形成受精卵后和胚裂早期，精子和卵子分别出现广泛的去甲基化，并产生新的甲基化特征[48]。有文献指出，哺乳动物发育过程中的表观遗传修饰，尤其是DNA甲基化，在决定细胞的分化潜力上起着重要作用，保证了机体的正常发育[49]。
在每一次的重新编程过程中，存在一系列调控DNA甲基化的蛋白因子。如脱氨基诱导激活蛋白（activation-induceddeaminase）被认为与去甲基化密切相关[50]。甲基胞嘧啶双加氧酶3（ten-eleven?translocation?3，Tet3）羟化酶等对于受精卵细胞中大范围的DNA去甲基化起重要作用[49]。然而，有趣的是，部分基因的表观遗传标记在重编程的过程中能够得以保留，成为“漏网之鱼”。一方面，某些特异的因子，如PGC7、Stella和Dppa3均可“冻结”Tet3的作用[51]；另一方面，Zfp57以及Kap1/Trim28等DNA结合因子可作为维持父系和母系印记基因甲基化状态的关键性因子[52]。因此推测，这些“漏网之鱼”可能是研究环境因素诱导的获得性表型跨代传递的关键。
三、表观遗传信息跨代遗传的分子机制
与DNA序列无关的、可遗传的基因调控方式，包括DNA局部结构与和核小体相位的改变、组蛋白的修饰、DNA甲基化、特殊RNA分子等称为表观遗传学调控（epigeneticcontrol）。目前该领域中，以DNA甲基化修饰、组蛋白共价修饰、非编码RNA等方面的研究更为成熟。
1.DNA甲基化修饰：DNA的甲基化修饰是目前受到广泛
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